Die Etablierung einer hepadnaviralen Infektion sowie die virale Replikation in Hepatozyten werden von löslichen, exogenen Substanzen, z.B. Zytokinen (TNF alpha, IFN gamma)1 oder Hormonen (Glukagon)2 entscheidend beeinflußt. Leberzellen haben in vivo über das Portalblut ständigen Kontakt zum Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS) gram-negativer Bakterien. LPS ist ein biologisch aktives Agens, das hauptsächlich in indirekter Weise wirkt: es regt Leberzellen zur Produktion und Sekretion von endogenen Botenstoffen an. Wir untersuchen den Einfluß von LPS auf die hapadnavirale Replikation am Modell des Duck Hepatitis B-Virus (DHBV).
Nach Zweistufen-Kollagenase-Perfusion der Leber von 2 bis 4 Wochen alten Enten über die Pfortader wurden durch differentielle Zentrifugation Hepatozyten (HC; 50×g) und kleinere Nichtparenchymzellen (NPC: Makrophagen, Endothelzellen, Itozelle, Fibroblasten; 250×g) sedimentiert und anschließend kultiviert. Die NPC wurden 3 h mit LPS (Salmonella minnesota, 20 ng/ml) stimuliert. Nach gründlichem Waschen wurde das Zellkulturmedium über 3 und 12 h gesammelt. Mit dem Zellkulturmedium stimulierter (Versuchsüberstand) und unstimulierter (Kontrollüberstand) NPC wurden HC am Tag 2 nach Plattierung behandelt und gleichzeitig mit DHBV (MOI: 25) infiziert.
Im Westernblot war die Menge an viralem Core-Protein im Zellysat von HC (Tag 6 nach Infektion), die mit dem Versuchsüberstand behandelt wurden, signifikant reduziert gegenüber HC, zu denen der Kontrollüberstand gegeben wurde. Die Virusproduktion im DNA-Dot-Blot des Zellkulturmediums (Tag 4-8 nach Infektion) war im Vergleich zu nicht behandelten HC um den Faktor 40 reduziert. Der Effekt des Versuchsüberstandes ging verloren, wenn enthaltene Proteine durch Kochen denaturiert wurden. Wurde das Versuchsmedium durch Gelfiltration fraktioniert, so bewirkte die Fraktion <5 kD keine Reduktion der viralen Replikation. Nach Auftrennung über FPLC zeigte die Fraktion des Molekularbereiches 20-60 kD die maximale Inhibition. Wurden die NPC gleichzeitig mit LPS und Cycloheximid (20 µg/ml) behandelt, konnte die Inhibition der viralen Replikation in den HC zum Teil aufgehoben werden. Wurde die NO-Synthetase der HC mit Monomethyl-L-arginin (95 nM) unterdrückt, hatte der Versuchsüberstand ebenfalls nur noch eine geringere Wirkung auf die virale Replikation.
Diese Daten zeigen, daß LPS die hepadnavirale Replikation in HC indirekt hemmt, indem es die Freisetzung löslicher Mediatoren durch NPC induziert. Bei den freigesetzten Polypeptidmediatoren handelt es sich vermutlich um Zytokine, die zum Teil nach LPS-Stimmulation neu synthetisiert werden. Durch solche Mediatoren wird u.a. NO in den HC induziert, das hemmend auf die virale Replikation wirkt. Wir haben damit das erste in vitro System zur Bestimmung und Untersuchung von Immunmodulatoren der hepadnaviralen Replikation in der Hand.
1 Guidotti L. G. et al., Immunity
(1996) 4: 25-36.
2 Hild M., Weber O.,
Schaller H., J Virol (1998), in press.