Regulation der hepadnaviralen Replikation: Untersuchung des Effektes antiviraler Mediatoren mit Hilfe hepadnaviraler Vektoren

U. Klöcker

Schematische Darstellung des Hepatitis B Virus. Mit freundlicher Genehmigung der Hepatitis Foundation, Neuseeland

Das humane Hepatits B Virus (HBV) ist ein weltweit verbreitetes Pathogen, welches ernsthafte Lebererkrankungen verursacht. Gegenwärtig sind etwa 350 Millionen Menschen chronisch mit HBV infiziert. HBV wird entweder horizontal durch sexuellen Kontakt, Blut und Blutprodukte oder vertikal während der Geburt von einer infizierten Mutter auf das Kind übertragen. 50 % der HBV-Infektionen bei Erwachsenen verlaufen symptomlos und die meisten akuten HBV-Erkrankungen heilen aus. In seltenen Fällen kommt es im Laufe einer akuten Lebererkrankung zu einer fulminanten Hepatitis mit einer hohen Mortalitätsrate. Bei 5–10 % der akut infizierten Erwachsenen und 90 % der infizierten Neugeborenen entwickelt sich jedoch eine chronische Hepatitis B, die mit einem hohen Risiko, an Leberzirrhose oder Leberkrebs zu erkranken, verbunden ist (Beasley et al., 1981; Hollinger, 1996) .

Zusammenfassung

Während meiner Promotion untersuchte ich den Einfluss des bakteriellen Endotoxins auf den Infektionsverlauf des Hepatitis B Virus. Es zeigte sich, dass das Endotoxin die hepadnavirale Replikation indirekt inhibiert, indem es die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren durch die Leberzellen induziert. Zur molekularbiologischen Charakterisierung der gehemmten Schritte im viralen Replikationszyklus wurde das Entenmodel der Hepatitis B Virus Infektion (DHBV) benutzt, in dem in vitro und in vivo Infektionsstudien durchführbar sind. Zur Charakterisierung der beteiligten Mediatoren wurde sowohl das DHBV-Modell als auch das immunologisch gut charakterisierte Mausmodell, in das das DHBV-Genom durch den adenoviralen Transfer eingeschleust wurde, eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass die nach LPS-Stimulation durch Nichtparenchymzellen der Leber freigesetzten antiviral wirkenden Mediatoren, darunter die Zytokine Interferon-alpha, Interferon-gamma und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha, einen posttranskriptionellen Schritt des hepadnaviralen Replikationszyklus' hemmen. Zusammenfassend kann aus den Daten geschlussfolgert werden, dass Leberzellen prinzipiell das Potential haben, die hepadnavirale Replikation effektiv zu inhibieren. Die Gründe für die Ausbildung einer chronischen Hepatitis B Infektion sind vermutlich im physiologischen Milieu der Leber zu suchen, welches den immunstimulatorischen Eigenschaften von Endotoxin entgegenwirkt.

Da rekombinante Hepatitis B Viren potentielle Kandidaten für den Leber gerichteten Gentransfer darstellen, war ein zweiter Aspekt meiner Doktorarbeit, rekombinante Hepatitis B Viren für den Einsatz als virale Vektoren zu optimieren. Hierfür wurde wiederum das Entenmodell der Hepatitis B Virus Infektion (DHBV) benutzt, da sich durch in vivo und in vitro Infektionsstudien kleinste Mengen replikationsfähigen Virus' detektieren lassen. Hinsichtlich der Insertion größerer Transgene wurde ein deletierbarer Bereich stromabwärts des S-Gens gefunden. Es zeigte sich außerdem, dass die rekombinanten Virusstocks Wildtypviren enthielten, die durch homologe Rekombination zwischen den Plasmiden mit replikationsdefizienten aber redundanten viralen Sequenzen entstanden waren. Durch die Verwendung einer Verpackungszelllinie zur Herstellung rekombinanter Virusstocks, konnte die Entstehung der Wildtypviren verhindert werden. Mit diesen sauberen rekombinanten Vektoren stehen nun Werkzeuge zur Verfügung, die als Vorbild für die Produktion humaner hepadnaviraler Vektoren dienen und die zur genaueren Untersuchung den hepadnaviralen Replikationszyklus eingesetzt werden können.

Systematische Einordnung

HBV ist der medizinisch bedeutsamste Vertreter aus der Familie der Hepadnaviren. Zu dieser Virusfamilie gehören membranumhüllte Animalviren. Wie der Name Hepadnaviren besagt, sind sie hepatotrop und haben ein DNA-Genom, das mit 3–3,3 kb zu den kleinsten unter den Animalviren gehört. Die Replikation der Hepadnaviren erfolgt wie bei den Retroviren (z.B. HIV) über ein RNA-Intermediat. Die reverse Transkription des RNA-Prägenoms findet im Zytoplasma der Wirtszelle statt, bevor die Viren die Wirtszelle verlassen, weshalb sie als Pararetroviren eingeordnet werden. Hepadnaviren wurden bei Säugern in Waldmurmeltieren, Erdhörnchen und Wolläffchen und bei Vögeln in Pekingenten (duck hepatitis B virus, DHBV), Reihern und Hausgänsen gefunden (Summers et al., 1978; Marion et al., 1980; Lanford et al., 1998; Mason et al. 1980; Sprengel et al., 1988) .

Auf Grund von Rezeptor- und Promotorspezifität zeigen Hepadnaviren ein sehr enges Wirtsspektrum und eine hohe Organspezifität. Das gilt insbesondere für die Säugerhepadnaviren. Das humane Hepatitis B Virus infiziert nur den Menschen oder Schimpansen und die HBV-Replikation ist auf Hepatozyten beschränkt. Die meisten Untersuchungen, etwa zur Entwicklung antiviral wirksamer Medikamente, werden an den dem humanen Hepatitis B Virus ähnlichen Hepadnaviren, z.B. DHBV, durchgeführt.

Morphologie

Die folgende Abbildung zeigt den Aufbau der Hepadnaviren. Die äußere Schicht ist eine von der Wirtsmembran stammende Lipidmembran, in der die viralen Hüllproteine verankert sind. Die Lipidmembran umgibt das ikosaedrische Nukleokapsid, welches meist aus 240, seltener aus 180 gleichen Untereinheiten des core-Proteins aufgebaut ist. Vom Nukleokapsid ist das partiell doppelsträngige zirkuläre DNA-Genom eingeschlossen. An das Genom ist die virale Polymerase über die terminale Protein-Domäne gebunden.

Morphologie von HBV- und DHBV-Partikeln. A: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von HBV- und DHBV-Partikeln (aus Schaefer et al., 1998) . B: Schematische Darstellung der Stuktur von HBV- und DHBV-Virionen. Die Virushülle ist von der Wirtsmembran abgeleitet und enthält die viralen Hüllproteine. Das ikosaedrische Nukleokapsid wird von identischen Untereinheiten des core-Proteins aufgebaut. Es umschließt das partiell doppelsträngige DNA-Genom, an das die virale Polymerase gebunden ist. Die Morphologie der Vogelviren unterscheidet sich geringfügig von der der Säugerviren. Die Virionen des DHBV sind etwas größer, sie haben einen Durchmesser von 55 nm.

Replikation

Die Replikation der Hepadnaviren verläuft, ähnlich der von Retroviren, über ein genomisches RNA-Intermediat, welches durch die virale reverse Transkriptase in genomische DNA umgeschrieben wird. Im Unterschied zu Retroviren, erfolgt die reverse Transkription bei den Hepadnaviren während der Reifung der Nukleokapside innerhalb der Wirtszelle. Die infektiösen viralen Partikel enthalten doppelsträngige DNA.

Replikationszyklus der Hepadnaviren. Nach Bindung und Eintritt des Virus in die Wirtszelle, gelangt das partiell doppelsträngige virale DNA-Genom in den Zellkern. Dort wirde es in die kovalent, geschlossene, zirkuläre DNA (covalently closed circular, cccDNA) umgewandelt. Die cccDNA ist das Template für die Transkription der viralen RNAs. Nach dem Export der viralen RNAs in das Zytoplasma werden die viralen Proteine translatiert. Die prägenomische RNA wird zusammen mit der viralen Polymerase enkapsidiert. Innerhalb der Nucleokapside wird die genomische RNA revers transkribiert. Die Nukleokapside werden umhüllt und verlassen die Zelle. Ein Teil der Nukleokapside wird zum Zellkern transportiert und dient dabei der Ausbildung eines cccDNA-Pools.

In der Abbildung ist der Replikationszyklus vereinfacht dargestellt. Das Virus bindet rezeptorvermittelt an die Hepatozytenmembran (Neurath et al., 1986; Klingmüller & Schaller, 1993) . Nach Fusion der Virushülle mit der Zellmembran gelangt das Nukleokapsid in das Zytoplasma. Das virale Genom im Nukleokapsid wird zum Zellkern transportiert und gelangt nach uncoating in den Zellkern. Dort wird das partiell doppelsträngige DNA-Genom durch zelluläre Enzyme vervollständigt - es wird die virale kovalent geschlossene, zirkuläre DNA (covalently closed circular, cccDNA) gebildet. Mit der initialen cccDNA-Konversion nach ca. 9-24 Stunden ist die virale Infektion etabliert (Köck & Schlicht, 1993) . Die cccDNA ist eine episomale virale DNA-Form, die als Template für die Transkription der viralen RNAs durch die zelluläre RNA-Polymerase II dient. Im Zytoplasma werden von diesen RNAs die viralen Proteine translatiert. Durch die Interaktion der Polymerase mit dem Verpackungssignal ε am 5'-Ende auf ihrer mRNA wird die Enkapsidierung des Komplexes aus prägenomischer RNA und Polymerase durch die Bindung von core-Dimeren initiiert (Junker-Niepman et al., 1990; Beck et al. 1997) .

Innerhalb des Nukleokapsids führen eine Reihe komplexer Vorgänge zur Synthese der viralen DNA durch die reverse Transkriptaseaktivität der viralen Polymerase (Nassal & Schaller, 1993; Ganem, 1996) . Ein Teil der reifen Nukleokapside wird zum Zellkern transportiert, wo die virale DNA der Amplifikation des nukleären cccDNA-Pools dient. Der andere Teil der Nukleokapside interagiert mit den viralen Hüllproteinen an der zellulären Membran und nach dem budding ins Endoplasmatische Retikulum oder in das intermediäre Kompartiment werden die Virionen freigesetzt (Patzer et al., 1986; Huovila et al., 1992) .

Wirt-Virus-Interaktion

Die mit der HBV-Infektion verbundenen eingangs beschriebenen Erkrankungen werden nicht vom Virus selbst hervorgerufen. Hepadnaviren sind, wie verschiedene Studien belegen, nicht direkt zytopathisch (Chisari et al., 1989; Chisari, 1992) . Die Immunantwort des Wirts ist für den Verlauf der hepadnaviralen Infektion von entscheidender Bedeutung.

Wie für die Elimination virusinfizierter Zellen allgemein beschrieben, so wurde bislang auch für HBV angenommen, daß zytotoxische T-Zellen durch die Zerstörung der infizierten Hepatozyten das Virus eliminieren. Da HBV aber nahezu alle Hepatozyten der Leber infizieren kann, ist es unwahrscheinlich, daß die Virusinfektion ausschließlich durch die Zerstörung der Hepatozyten beseitigt wird. Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass in der Mehrzahl der Hepatozyten die HBV-Replikation durch Zytokine, vor allem Interferon-gamma (IFN-γ) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α), aber auch Interferon-alpha und -beta (IFN-α/β) herunterreguliert wird (Guidotti et al., 1994b; Guidotti et al., 1996b; Schultz et al., 1999a/b; McClary et al., 2000) .

IFN-γ und TNF-α beeinflussen zwei Schritte des HBV-Replikationszykluses: Die virale Genexpression wird posttranskriptionell durch die Destabilisierung der viralen RNA im Hepatozytenkern gehemmt. Das ist verbunden mit der proteolytischen Spaltung eines zellulären Proteins, das normalerweise an die HBV-RNA bindet und sie stabilisiert (Tsui et al., 1995; Heise et al., 1999a,b) . Außerdem wird die virale Replikation durch die Elimination viraler Nukleokapside gehemmt (Wieland et al., 2000) .

Hepadnaviren sind demnach in der Lage, auf äußere Einflüsse, wie zum Beispiel Zytokine, zu reagieren und ihren Replikationszyklus an die Gegebenheiten im Wirt anzupassen.

Endotoxin und die Wechselwirkung mit Leberzellen

Die bakteriellen Lipopolysaccharide (LPS) aus der Zellwand Gram-negativer Darmbakterien, die in großen Mengen vom Dünndarm über die Pfortader zur Leber gelangen, sind potente Endotoxine mit immunstimulatorischen Eigenschaften.

Das Endotoxin ist für die pathogenen Eigenschaften Gram-negativer Bakterien verantwortlich. Während für niedrige LPS-Konzentrationen im Blut immunstimulatorische Eigenschaften mit erhöhter Resistenz gegen Infektionen und Malignität beschrieben wurden (Vogel & Hogan, 1990) , sind hohe Konzentrationen, wie sie während der Infektion mit Gram-negativen Bakterien oder durch die Translokation von Enterobakterien aus dem Darm auftreten, mit pathophysiologischen Reaktionen, die im septischen Schocksyndrom gipfeln können, verbunden.

Endotoxin ruft diese biologischen Effekte in einer indirekten Art und Weise hervor. Es aktiviert hauptsächlich Monozyten/Makrophagen, die Schlüsselzellen der angeborenen Immunantwort, aber auch Endothelzellen, Zellen der glatten Muskulatur und Neutrophile Mediatoren freizusetzen. Zu diesen Mediatoren gehören bioaktive Lipide (wie Plättchen-aktivierender Faktor und Thromboxan), Prostaglandine, Sauerstoffradikale, NO, Proteine (wie Interleukin-1 und 6) und TNF-α. Hohe Konzentrationen an LPS im Blut führen zur Freisetzung großer Mengen dieser Mediatoren, welche die pathophysiologischen Reaktionen hervorrufen (Schletter et al., 1995) . Der Lipid A-Teil des Endotoxins ist die kleinste Komponente, die die gleichen biologischen Aktivierungseigenschaften wie LPS selbst zeigt (Galanos et al., 1985) .

Die Leber ist das Hauptorgan, das Endotoxin aus dem Blut beseitigt (Braud et al., 1955; Carey et al., 1958; Zlydaszyk & Moon, 1976; Musson et al., 1978; Freudenberg et al., 1982; Klein et al., 1985) . Wahrscheinlich kommt diese Aufgabe hauptsächlich den Nichtparenchymzellen der Leber (Kupffer- und Endothelzellen) zu (Mathison & Ulevitch, 1979) . Kupfferzellen werden dadurch stimuliert Tumor-Nekrose-Faktor-alpha und Eikosanoide freizusetzen (Wendel et al., 1998) . In neueren Untersuchungen wurde gezeigt, dass LPS auch von Hepatozyten aufgenommen wird (Mimura et al., 1995) . Über die Galle wird es von den Leber ausgeschieden.

Für Lentiviren, das Vaccinia Virus und Reoviren wurde gezeigt, daß LPS die Replikation dieser Viren hemmt, indem es Makrophagen aktiviert immunologisch wirksame Mediatoren freizusetzen (Smith et al., 1998; Keller et al., 1985; Pertitle et al., 1996) . An dieser Wirkung waren Zytokine und NO beteiligt. Durch den ausgeprägten Kontakt der Leber zu bakteriellem Endotoxin liegt die Vermutung nahe, daß auch die Replikation des Hepatitis B Virus in den Hepatozyten durch die von Leberzellen freigesetzten Mediatoren beeinflußt wird.

Gentherapie

Obwohl ein effektiver Impfstoff gegen HBV zur Verfügung steht, gibt es für die weltweit 350 Million chronisch Infizierten bis jetzt keine zufriedenstellende Therapie. Zur Zeit werden hierfür IFN-α (Perrillo et al., 1990) und Nukleosidanaloga (Ueda et al., 1989; Doong et al., 1991; Berk et al., 1992) systemisch eingesetzt. Jedoch kommt es in Folge der Behandlung mit Nukleosidanaloga zur Entstehung von resistenten Viren und die Therapie mit IFN-α ist nur in weniger als einem Drittel aller Patienten erfolgreich. Die systemische Gabe von Zytokinen ist außerdem generell mit starken Nebenwirkungen verbunden.

Hinzu kommt, dass die Leber eine umfassende Stellung im Intermediärstoffwechsel hat. Deshalb ist es nicht überraschend, dass sich viele angeborene Gendefekte, wie Phenylketonurie, Hypercholesterolämie und Hämophilie, in den Hepatozyten manifestieren. Die Lebertransplantation, als einziger möglicher Ausweg, ist jedoch mit einer hohen Morbidität verbunden und durch die geringe Verfügbarkeit von Organen limitiert.

Die Gentherapie könnte eine alternative Behandlung darstellen. Mit lebergerichteten Vektoren ist es möglich, sowohl Gene antiviral wirkender Substanzen als auch Gene, die die angeborenen Gendefekte korrigieren, direkt in die Leber zu transferieren und in ihr zu exprimieren. Virale Gentransfersysteme basieren auf rekombinanten replikationsinkompetenten Viren, die alle viralen regulatorischen Elemente, die zur Herstellung rekombinanter Viren notwendig sind, und die therapeutisch bedeutsamen Gene auf dem viralen Genom tragen, jedoch keine viralen Gene exprimieren. Virale Vektoren entsprechen in den frühen Schritten des Replikationszyklus - wie der Bindung an die Wirtszelle, des Viruseintritts und des Transfers des Genoms in die Zelle - dem Ausgangsvirus. Zur Produktion rekombinanter replikationsinkompetenter Vektoren ist es erforderlich, die fehlenden viralen Proteine durch Expressionsvektoren in trans zur Verfügung zu stellen. Alternativ können Verpackungszelllinien, die durch stabile Transfektion der Expressionsplasmide gewonnen wurden, dafür benutzt werden.

Weil das natürliche Infektionsziel der Hepadnaviren die ruhenden Hepatozyten sind, eignen sie sich besonders zur lebergerichteten Gentherapie. Hepadnaviren sind nicht zytopathisch. Ein weiterer Vorteil ist, daß Hepadnaviren auf Grund leberspezifischer Promotor- und Enhancer-Elemente ausschließlich in Hepatozyten replizieren und ihr Replikationszyklus gut untersucht ist. Nachteilig bei der Produktion hepadnaviraler Vektoren ist die Größenrestriktion des Genoms. Wird die Genomlänge um mehr als 10 % überschritten, ist die reverse Transkription sehr ineffizient (Chiang, 1992) . Außerdem umfassen 15 % des Genoms regulatorische cis-aktive Elemente, die für Transkription und Verpackung erforderlich und über das Genom verteilt sind. Es ist deshalb nicht möglich, beliebige virale Sequenzen gegen Fremdgene auszutauschen.

Da es möglich ist, virale Genprodukte für die Produktion von rekombinanten Hepadnaviren zu transkomplementieren (Schlicht et al., 1989; Horwich et al., 1990) , können virale Sequenzen durch Transgene ausgetauscht werden. Die Produktion infektiöser rekombinanter DHBV, die an Stelle des viralen S-Gens das Gen des grün fluoreszierenden Proteins oder des Enten-IFN-α-Gen trugen, ist bereits gelungen. Von beiden Vektoren wurde das Transgen exprimiert (Protzer et al, 1999) . Demnach befinden sich in der Region des viralen S-Gens keine essentiellen regulatorischen Elemente.