Bis vor kurzem waren RNA-Moleküle relativ unbeachtet, sie stellten für viele Wissenschaftler nicht mehr als Überträger des genetischen Codes in Proteinsequenzen dar. Aus neueren Publikationen geht aber immer klarer hervor, daß eine bestimmte Klasse kleiner RNA-Moleküle wesentlich an der Kontrolle der Zelle über die Steuerung der Genexpression beteiligt ist.
Die Expression eines Gens kann auf verschiedenen Ebenen in der zum reifen Protein führenden Reaktionskette kontrolliert werden. Dabei wurden bislang fünf potentielle Kontrollpunkte unterschieden:
Aktivierung der Genstruktur:
Den ersten Kontrollpunkt stellt der strukturelle Zustand der DNA
dar. Gene, die in einer Zelle exprimiert werden, liegen in einem
"aktiven" strukturellen Zustand vor.
Initiation der Transkription:
Die Transkription eines Gens in einem aktiven Zustand wird während der
Initiation, der Interaktion der RNA-Polymerase mit dem Promotor,
kontrolliert. Für die Expression der meisten Gene ist dieser
Kontrollpunkt der wichtigste.
Prozessierung des Transkriptes und Transport in das
Zytoplasma:
Das primäre Transkript wird durch Capping am 5`-Ende und durch
Polyadenylierung am 3`-Ende modifiziert, die Introns werden
gespliced. Die auf diese Weise gereifte RNA wird für die Translation
aus dem Zellkern in das Zytoplasma transportiert. Die Regulation der
Genexpression kann alle diese Schritte umfassen. Dem differenziellen
Splicing kommt dabei eine bedeutende Rolle zu, da es den Typ des
Proteinproduktes kontrolliert.
Translation der mRNA:
Die Translation wird während der Initiation durch die Bindung von
Transkriptionsfaktoren an den Transkriptionskomplex reguliert.
Einen weiteren, bisher allerdings wenig beachteten Kontrollpunkt stellt das posttranskriptionellen Gensilencing (post trancriptional gene silencing, PTGS) dar. Nuclear run on Assays haben gezeigt, daß dabei eine funktionale mRNA gebildet wird. Jedoch führen verschiedene Mechanismen in der Zelle dazu, dass die entstandene mRNA degradiert wird und damit keinen Eingang in die Translation findet (van Blokland et al., Plant J, 1994; de Carvalho, EMBO J, 1992). Das PTGS, initiiert durch die Einführung doppelsträngiger RNA (dsRNA), wird als RNA-Interferenz (RNAi) bezeichnet. Dieser Begriff wurde 1998 von Fire et al. geprägt, als sie die Beobachtung beschrieben, die durch Injektion von dsRNA in Caenorhabditis elegans zu einem Block der Expression von hoch homologen Genen führte (Nature, 1998).
Die eigentliche Entdeckung der RNAi liegt länger zurück. Sie wurde 1990 von den Forschungsgruppen Jorgensen und Mol beschrieben, als sie pigmentproduzierende Gene (Dihydroflavonol-4-reduktase oder Chalconsynthase) in Petunien einbrachten, um die Farbe der Blüten zu intensivieren (Napoli et al., Plant Cell, 1990; van der Krol et al., Plant Cell, 1990). Die überwiegende Anzahl der genetisch veränderten Pflanzen hatte jedoch stattdessen weiße Blüten. Da sowohl die Expression des Transgens als auch des homologen, endogenen Gens unterdrückt waren, nannten sie das Phänomen Co-Suppression.
Aus dem, was bis heute über den Mechanismus der RNAi bekannt ist, kann folgendes Grundmodell konstruiert werden, siehe Abbildung.
Mechanismus der RNA-Interferenz. Die dsRNA wird von dem Enzym Dicer erkannt und in doppelsträngige, 21-25nt lange siRNAs zerschnitten, die den gesamten dsRNA-Sequenzbereich umfassen. Die siRNA-Duplexe werden von einem Enzymkomplex gebunden, wodurch ein RNA induzierter Silencing Komplex (RISC) entsteht. Nach Entwindung der siRNA wird durch homologe Basenpaarung die Ziel-mRNA vom Antisense-siRNA-Stranges im Enzymkomplex hoch spezifisch gebunden. Ausgehend von der Interaktionsstelle wird die mRNA degradiert.
Das den Mechanismus auslösende Molekül ist dsRNA (Fire et al., Nature, 1998). Diese wird durch eine dsRNA spezifische Ribonuklease aus der RNase III Familie, dem sogenannten Dicer, ATP abhängig zerschnitten (Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1998). Die entstehenden small interfering RNAs (siRNAs) sind doppelsträngig und korrespondieren mit der sense und antisense Sequenz der mRNA. Sie haben eine Größe von 21 bis 25 Nukleotiden (Hamilton and Baulcombe, Science, 1999). Der siRNA-Pool repräsentiert den gesamten Sequenzbereich der dsRNA. Die Bildung der siRNAs von einem dsRNA-Precursor Molekül wurde in D. melanogaster und Arabidopsis nachgewiesen und in C. elegans durch die Injektion radioaktiv markierter dsRNA demonstriert (Tuschl et al., Genes Dev, 1999; Zamore et al., Cell, 2000; Dalmay et al., Cell, 2000; Parrish et al., Mol. Cell, 2000; Parrish and Fire, RNA, 2001).
Die siRNA-Duplexe sind die Hauptspieler der RNAi (Elbashir et al., Nature, 2001; Elbashir et al., Genes Dev, 2001). Sie werden von einem Enzymkomplex erkannt und gebunden, wodurch ein RNA induzierter Silencing Komplex (RISC) entsteht. Die genaue Zusammensetzung dieses Enzymkomplexes ist noch nicht endgültig geklärt (Hammond et al., Science, 2001; Cerutti et al., Trends Biochem Sci, 2000; Williams and Rubin, Proc Natl Acad Sci, 2002; Grishok et al., Cell, 2001; Schwarz and Zamore, Genes Dev, 2002). Er besitzt eine Helikase-Aktivität, die die gebundenen siRNA-Moleküle ATP-abhängig entwindet und dadurch zur Aktivierung des Komplexes führt.
Der aktivierte RISC-Komplex adressiert das homologe Transkript durch Basenpaarung des Antisense-siRNA-Stranges mit der mRNA (Hammond et al., Nature, 2000). Da diese Interaktion sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma stattfindet, werden RNAs, die polycistronisch transkribiert werden, separat erkannt. Ausgehend von der Interaktionsstelle wird die mRNA gespalten. Der genaue Ablauf der Spaltungsreaktion ist noch nicht vollständig bekannt. Die RNA-Interferenz ist ein sehr spezifischer Mechanismus für die Degradation einer bestimmten mRNA. Dabei wird die Spezifität durch die Bindung der Antisense-siRNA an die mRNA bedingt. Stimmt die Zielsequenz auf der mRNA nicht 100%ig mit der Sequenz der Antisense-siRNA überein, wird die mRNA nicht degradiert. Durch die Wirkung der siRNAs wird die Umschrift von RNA in Protein blockiert.
In Abhängigkeit vom untersuchten Organismus, wurden einige Abweichungen von diesem Grundmodell gefunden. So weist beispielsweise die Beobachtung (in C. elegans), daß ein paar wenige dsRNA Moleküle pro Zelle ausreichend sind, um komplett mit der Genexpression zu interferieren, auf eine katalytische oder amplifizierende Komponente hin (Montgomery and Fire, Trends Genet., 1998; Fire et al., Nature, 1998). Dabei könnte die an die mRNA gebundene Antisense-siRNA als Primer für eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRPs) dienen und durch deren Aktivität verlängert werden (Smardon et al., Curr Biol, 2000; Sijen et al., Cell, 2001; Tijsterman et al., Science, 2002; Martens et al., Mol Biol Cell, 2002; Lipardi et al., Cell, 2001). Das Produkt dieser Reaktion wäre ein weiteres dsRNA-Substrat, welches durch Dicer in sekundäre siRNAs gespaltet werden kann (Sijen et al., Cell, 2001).
Der ursprünglich in Pflanzen entdeckte Mechanismus wurde mittlerweile in einer Reihe von Organismen nachgewiesen: in Pilzen, z.B. Neurospora crassa, Saccharomyces pombe, in Nematoden, Caenorhabditis elegans, in Insekten, Drosophila melanogaster, und in Säugern, z.B. in Mäusen und humanen Zellen (Fire et al., Nature, 1998; Elbashir et al., EMBO J, 2001; Elbashir et al., Natur, 2001). Innerhalb der Eukaryonten sind die an der RNA-Interferenz beteiligten Enzyme stark konserviert, was auf einen evolutionär erhaltenen Mechanismus mit einer umfassenden Bedeutung für eukaryontische Zellen hindeutet.
Über die Funktionen, die die RNA-Interferenz in eukaryontischen Zellen hat, gibt es verschiedene Spekulationen. So könnte ihr ein Abwehrmechanismus gegen bestimmte virale Infektionen und gegen DNA-Transposition zukommen, sie hat außerdem wahrscheinlich auch genregulatorische Bedeutung während verschiedener Entwicklungsabläufe.
Die RNA-Interferenz wird als Abwehrmechanismus gegen Infektionen mit bestimmten RNA-Viren diskutiert, da im Lebenszyklus vieler RNA-Viren (z.B. Cytomegallie Virus (CMV), Flock house virus (FHV)) doppelsträngige RNA Moleküle auftreten, siehe schematische Darstellung (Mourrain et al., Cell, 2000; Vance and Vaucheret, Science, 2001; Voinnet, Trends Genet, 2001; Marathe et al., Plant Mol Biol,2000).
RNA-Interferenz als Schutzmechanismus vor viralen Infektionen. Das Ziel einer Virus-Infektion besteht darin, mit Hilfe des Stoffwechsels in der Wirtszelle Nachkommenviren zu produzieren. Dafür ist die Synthese viraler Proteine sowie viraler Genome erforderlich. Viele RNA-Viren müssen zu diesem Zweck doppelsträngige RNA synthetisieren, die sie dann dem RNA-Interferenz-Mechanismus aussetzt.
Das Genom von RNA-Viren kann entweder einzelsträngige RNA sein, die die gleiche Polarität wie mRNA besitzt (positiv- oder messenger-sense RNA), es kann einzelsträngige RNA mit entgegengesetzter Polarität zur mRNA sein (negativ- oder anti messenger-sense RNA) oder es kann doppelsträngige RNA sein, die vermutlich direkt von Dicer erkannt wird.
Nach dem Eintritt des Virus in die Zelle besteht das Ziel des Virus darin, die Stoffwechselfunktionen der Wirtszelle auszunutzen, um zu replizieren und dadurch Nachkommenviren zu bilden. Dafür ist einerseits die Produktion viraler Proteine erforderlich. Die virale mRNAs können bei messenger-sense und doppelsträngigen RNA Viren direkt von dem Genom transkribiert werden. Bei anti messenger-sense RNA Viren muß das RNA-Genom erst in mRNA umgeschrieben werden, bevor es zur Proteinsynthese kommen kann.
Zur Bildung von Nachkommenviren ist außerdem erforderlich, daß das virale Genom mit der korrekten Polarität gebildet wird. Da es beispielsweise nicht möglich ist, daß positiv strängige RNA direkt von positiv strängiger RNA synthetisiert wird, gehen viele RNA-Viren einen Umweg über die Synthese von dsRNA, von der dann das entsprechende Genom transkribiert wird. Damit setzen sie sich dem Angriff der RNA-Interferenz aus. Die Hinweise, daß die RNAi einen Abwehrmechanismus gegen RNA-Viren darstellt, kommen aus pflanzlichen und tierischen Defekt-Organismen, die hypersensitiv gegenüber viralen Infektionen sind (Mourrain et al., Cell, 2000; Vance and Vaucheret, Science, 2001; Voinnet, Trends Genet, 2001; Marathe et al., Plant Mol Biol, 2000).
Die RNA-Interferenz stellt vermutlich auch einen Abwehrmechanismus gegen Transposition dar (Wu-Scharf et al., Science, 2000; Ketting et al., Cell, 1999; Aravin et al., Curr Biol, 2001; Ngo et al., Proc Natl Acad Sci, 1998).
Transposons sind bewegliche DNA-Segmente, siehe Abbildung. Die Enden eines Transposons werden spezifisch von einem Enzym, der Transposase erkannt. Nach der Bindung der Transposase spaltet sie das Transposon aus der DNA ab und interagiert mit einer anderen Genomsequenz. Anschließend katalysiert sie die Insertion des Transposons in diese Ziel-DNA.
RNA-Interferenz als Schutzmechanismus vor Transposition. Die terminalen Transposon-Sequenzen werden spezifisch durch die Transposase erkannt. Nach dem Ausschneiden der Transposonsequenz aus der Donor-DNA interagiert die Transposase mit der Ziel-DNA-Sequenz und katalysiert die Insertion des Transposons.
Transposons haben für die Evolution eine umfassende Bedeutung, denn sie dienen dem Rearrangement der DNA. Da sie ungerichtet in die DNA integrieren, können sie aber auch Mutationen erzeugen und Onkogene aktivieren.
Je nach Integrationslokus können durch die Transkription von Wirtspromotoren von der Transposonsequenz komplementäre RNA-Moleküle gebildet werden, die durch homologe Basenpaarung zur Bildung von dsRNA führen, siehe Abbildung. Der Abbau dieser dsRNA Moleküle durch die RNAi würde die Wirtszelle vor der Synthese defekter Proteinmoleküle schützen.
Synthese doppelsträngiger RNA von Transposonsequenzen. Durch die Transkription von Transposonsequenzen gesteuert durch flankierende Wirtspromotoren, entstehen komplementäre RNA-Moleküle, die durch homologe Basenpaarung dsRNA bilden.
Eine weitere Klasse von Transposons stellen die Retrotransposons dar. Diese breiten sich generell über RNA-Intermediate im Genom aus, und sind durch das Auftreten der RNA-Moleküle vermutlich direkt der Degradation durch die RNAi unterworfen.
Die Hinweise, daß die RNAi auch für die Abwehr von Transposons eine entscheidende Rolle spielt, stammen ebenfalls aus Defekt-Organismen (C. elegans und Drosophila), bei denen sich eine erhöhte Transpositionsrate nachweisen ließ (Wu-Scharf et al., Science, 2000; Ketting et al., Cell, 1999; Aravin et al., Curr Biol, 2001; Ngo et al., Proc Natl Acad Sci, 1998).
Einige Komponenten des Silencing-Pathways sind mit genregulatorischen Mechanismen, die Entwicklungsabläufe steuern, verbunden (Grishok et al., Cell, 2001; Ketting et al., Genes Dev, 2001; Knight and Bass, Science, 2001; Pasquinelli et al., Nature, 2000; Hutvagner et al., Science, 2001;). So wurden in Drosophila Gene gefunden, von denen RNAs transkribiert werden, die keinerlei kodierende Funktion besitzen. Über die translationale Regulation von downstream Zielgenen steuern sie aber den zeitlichen Ablauf von Entwicklungsereignissen (Lee et al., Cell, 1993; Reinhart et al., Nature, 2000;). Vermutlich können diese RNA-Moleküle dsRNA-Haarnadelstrukturen ausbilden, die durch Dicer in small temporal RNAs (stRNAs) prozessiert werden. Die stRNAs haben ungefähr die gleiche Göße wie siRNA und wurden in C. elegans, Drosophila und humanen Zellen nachgewiesen (Pasquinellli et al., Nature, 2000; Hutvagner et al., Science, 2001; Ketting et al., Genes Dev, 2001;).
Defektorgnismen, die kein aktives Dicer-Enzym bilden können und damit die stRNAs nicht prozessieren können, zeigen Abnormalitäten in der Entwicklung bis hin zur Sterilität (Lee et al., Cell, 1993; Reinhart et al., Nature, 2000; Grishok et al., Cell, 2001; Ketting et al., Genes Dev, 2001; Knight and Bass, Science, 2001;).
Vermutlich sind die kürzlich in C. elegans, Drosophila und humanen Zellen gefundenen mikro-RNAs (mi-RNAs) mit stRNAs vergleichbar (Lagos-Quintana et al., Science, 2001; Lau et al., Science, 2001; Lee and Ambros, Science, 2001; Mourelatos et al., Genes Dev, 2002). Man nimmt an, daß sie ebenso wie stRNAs aus doppelsträngigen Vorläufermolekülen durch Dicer prozessiert werden. Daß sie regulatorische Funktionen haben, wird durch die Beobachtungen gestützt, daß viele der miRNAs eine hohe Gewebespezifität und enges Zeitfenster besitzen.
Mittlerweile ist die RNA-Interferenz zu einem der heißesten Themen in der Molekularbiologie geworden, da sie ein effektives Werkzeug zur funktionellen Untersuchung von Genen darstellt. Das ist dadurch möglich, da exogene dsRNAs oder siRNAs in die Zelle transfiziert werden können und dort zu einer effektiven und spezifischen Expressionsinhibition von Targetgenen führen. Die RNA-Interferenz wird deshalb in der biomedizinischen Grundlagenforschung zur funktionellen Genanalyse herangezogen. Für Arzneimittel-entwickelnde Unternehmen stellt sie ein sehr schnelles Screening-Tool zur Target-Identifizierung, zur Target-Validierung und zum Drug-Screening im high throuput Maßstab dar. Der Mechanismus der RNA-Interferenz wird sogar als Therapiekonzept in Erwägung gezogen, bei dem die siRNA selbst als Therapeutikum fungiert.
Zudem bietet die RNA-Interferenz gegenüber den bisher für das spezifische gene-knock-down angewandten RNA-Technologien, wie dem Einsatz von Ribozymen und Antisense-Oligonukleotiden, einige Vorteile, die im Folgenden erläutert werden.
Für die erfolgreiche Anwendung aller genannten RNA-Technologien, einschließlich der RNAi, ist es - sowohl für einen Zellkulturansatz als auch für eine Anwendung im Versuchstier oder als Therapeutikum im Patienten - entscheidend, daß die verwendeten Moleküle folgende Eigenschaften aufweisen:
Bei allen genannten RNA-Technologien erfolgt die Erkennung des mRNA-Targets über homologe Basenpaarung. Gegenüber Antikörpern, die Proteine adressieren und extrazellulär wirken, haben sie den Vorteil, daß sie bereits auf der Ebene der mRNA in den Prozess der Genexpression eingreifen.
Ribozyme sind einzelsträngige RNA-Moleküle, die enzymatisch aktiv sind. 1983 hat T.R. Cech (Nature) das erste cis-aktive Ribozym beschrieben, eine prä-ribosomale RNA in Tetrahymena thermophilia (Protozoa, Ciliat), die ihr eigenes Intron ausschneidet. Kurze Zeit später entdeckte S. Altman (Nucleic Acids Res, 1983) das erste trans-aktive Ribozym, das eine RNA-Untereinheit des RNase-Komplexes hydrolisiert. Dabei richtete sich die Wirkung in trans gegen eine tRNA. Cech und Altmann haben zusammen für ihre Entdeckungen 1989 den Nobelpreis für Chemie erhalten.
Die ursprünglich cis-aktiven Ribozyme haben Molekularbiologen zum Studium der Genfunktionen und für die therapeutische Anwendung verändert, siehe Abbildung. Sie besitzen neben einer katalytischen Domäne zwei Substratbindungsarme, die spezifisch die RNA-Sequenz erkennen. Die Bindungsarme fischen aus dem RNA-Pool der Zelle durch homologe Basenpaarung die Ziel-RNA heraus, die dann von der RNase-Aktivität des Ribozyms zerschnitten wird. Damit findet die Ziel-mRNA keinen Eingang in die Translation, das entsprechende Protein kann nicht synthetisiert werden.
Funktionsweise von Ribozymen. Neben einer katalytischen Domäne besitzen Ribozyme zwei Substratbindungsarme, die spezifisch die RNA-Sequenz erkennen und durch homologe Basenpaarung die Ziel-RNA aus dem RNA-Pool der Zelle fischen. Diese wird von der RNase-Aktivität des Ribozyms zerschnitten wird.
Die Nachteile von Ribozymen bestehen darin, daß sie als einzelsträngige Ribonukleinsäure-Moleküle gegenüber Hydrolasen (RNasen) sehr empfindlich sind. Durch einige Tricks ist aber eine Stabilisierung der Ribozyme möglich. Die Wirkung von Ribozymen wird außerdem durch sekundäre und tertiäre Faltungen der Ziel-RNA stark beeinträchtigt. Auf Grund dessen können Ribozyme nicht an jede Ziel-mRNA binden und dadurch diese nicht prozessieren. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß Ribozyme nicht so leicht in Zellen einzuschleusen sind.
Trotz aller Nachteile werden Ribozyme von der US-Firma SIRNA zum Einsatz als Medikamente entwickelt. Das Unternehmen hatte bis vor kurzem drei Ribozym-basierte Medikamente in der klinischen Phase. Die Entwicklung eines dieser Medikamente wurde eingestellt, da sich herausstellte, daß es im Patienten nicht die gleiche gute Wirkung wie in der Zellkultur hatte. Die zwei weiteren Medikamente sollen als Krebstherapeutika eingesetzt werden.
Antisense-Oligonukleotide sind synthetische einzelsträngige Ribo- oder Desoxiribonukleinsäure-Moleküle. 1978 wurde erstmals die Wirkung von Antisense-Oligonukleotiden beschrieben, als Zamecnik und Stephenson die Replikation des Rous Sarkoma Virus durch das Einbringen von Antisense-Oligonukleotiden in Zellen inhibieren konnten (Stephenson, Proc Natl Acad Sci, 1978; Zamecnik, Proc Natl Acad Sci, 1978).
Die Wirkung der 15-20 Basen langen Oligonukleotide ist sehr ähnlich zur Funktionsweise der Ribozyme, siehe Abbildung. Die Bindung erfolgt wie bei Ribozymen durch homologe Basenpaarung an die komplementäre Sequenz der Ziel-mRNA. Die entstandenen DNA-RNA-Chimären aktivieren die RNase H, die die Ziel-mRNA zerschneiden und dadurch die Expression des korrespondierenden Gens blockieren. Es wurden auch schon Antisense-Oligonukleotiden konstruiert, die nicht die RNase H aktivieren sondern durch sterische Hinderung die Translation der mRNA blockieren.
Funktionsweise von Antisense-Oligonukleotiden. Durch homologe Basenpaarung bindet das Antisense-Oligonukleotid an die komplementäre Sequenz der Ziel-mRNA. Die entstandenen DNA-RNA-Chimären aktivieren die RNase H, die die Ziel-mRNA zerschneiden.
Der Vorteil von Antisense-Oligonukleotiden liegt gegenüber Ribozymen darin, daß sie sehr gut zellgängig sind. Ihre Nachteile liegen wiederum in der Anfälligkeit gegenüber Exo- und Endonukleasen, was sich aber durch chemische Modifikationen verhindern läßt. Besonders stabil sind die Phosphorthioat-DNAs, bei denen ein Sauerstoffatom aus der Phosphatgruppe gegen ein Schwefelatom ausgetauscht wird (Eckstein, Chem Ber, 1969; Matsukura, Proc Natl Acad Sci, 1987).
Das einzige bisher zugelassenes Antisense Medikament ist Vitravene der US-Firma ISIS Pharmaceuticals. Hierbei handelt es sich um ein stabilisiertes Oligonukleotid (Phosphorthioate) welches gegen die durch das Cytomegalovirus hervorgerufene Retinitis eingesetzt wird. Leider ist dieses Medikament fast schon wieder aus den Apotheken verschwunden, da die antivirale Wirkung durch die niedrige Zellpermeabilität des Wirkstoffes nur sehr gering ist. Das Unternehmen hat sechs weitere Phosphothioate in den klinischen Phasen II und III.
In Säugerzellen kann der Mechanismus der RNA-Interferenz nicht mittels dsRNA induziert werden, da sich im laufe der Evolution bei Säugern ein weiterer dsRNA-basierten Mechanismus zur Abwehr von RNA-Viren entwickelt hat: Das Enzym Protein Kinase R (PKR) bindet sequenzunabhängig an die dsRNA. Die PKR wird dadurch autophosphoryliert und aktiviert durch Phosphorilierung den Translationsfaktor eIF2a. Über weitere enzymatische Zwischenschritte wird die gesamte zelluläre Translation inhibiert. Die Zelle nimmt dadurch einen anitiviralen Status ein, der durch Wachstumshemmung und Apoptose gekennzeichnet ist.
Die Arbeitsgruppe von Thomas Tuschl konnte als erste zeigen, daß die RNA-Interferenz trotzdem auch in Säugern funktioniert, in dem sie kleine doppelsträngige RNA-Moleküle in die Zellen einbrachten, die nicht länger als 30 Nukleotide (siRNA) waren (Elbashir et al., Nature, 2001). Vermutlich sind die siRNAs zu kurz, um von der PKR erkannt zu werden und den PKR-Signaltransduktionsweg zu aktivieren.
Funktionsweise der RNA-Interferenz in eukaryontischen Zellen. siRNA-Moleküle, die kürzer als 30 Nukleotide sind, werden von dem RISC-Enzymkomplex erkannt und induzieren in eukaryontischen Zellen die RNA-Interferenz. Nach Entwindung der siRNA wird durch homologe Basenpaarung die Ziel-mRNA vom Antisense-siRNA-Stranges im Enzymkomplex hoch spezifisch gebunden. Ausgehend von der Interaktionsstelle wird die mRNA degradiert.
Die Vorteile des siRNA induzierten PTGS liegen gegenüber Ribozymen und Anisens-Oligonukleotiden in ihrer 10-100fach höheren Effizienz und in ihrer größeren Stabilität. Während Ribozyme und Antisense-Oligonukleotide einzelsträngige RNA- oder DNA-Moleküle sind, die dem Abbau durch Nukleasen besonders zugänglich sind, sind siRNAs kurze, doppelsträngige Moleküle, und stellen damit kein direktes Angriffsziel von Nukleasen dar. Daß sie trotzdem nach einiger Zeit im Blutplasma oder der Zelle degradiert werden, könnte auf das allmähliche Aufschmelzen der doppelsträngigen siRNAs zurückzuführen sein, aus dem einzelsträngige RNA-Moleküle hervorgehen, die dann genau wie Ribozyme oder Antisense-Oligonukleotide durch Nukleasen degradiert werden.
Nachteilig sind jedoch ihre (momentanen noch) relativ hohen Kosten und ihre ungewisse Erfolgsrate. So müssen, je nach zu Grunde gelegtem Design-Algorithmus, pro Target 2-4 verschiedene siRNA Moleküle ausgetestet werden, um eine effektive siRNA zu finden. Zu dem mehren sich die Hinweise auf Off-Target-Effekte, eine ungewollte Expressions-Inhibition von unbeteiligten Genen (Scacheri, Proc Natl Acad Sci, 2004; Jackson, Nat Biotechnol, 2003). Des weiteren wurde beobachtet, daß manche siRNAs die Interferonantwort aktivieren, während andere das nicht tun (Sledz et al., Nat Cell Biol, 2003). Womit die Aktivierung der Interferonantwort zusammenhängt ist nicht geklärt. Es wird postuliert, daß es von der verwendeten siRNA selbst abhängig ist. Eine andere Vermutung ist, daß synthetisch hergestellte siRNAs nicht zur Aktivierung der Interferonantwort beitragen, während sie von in vivo exprimierten siRNAs hervorgerufen wird.
Prinzipiell existieren zwei Möglichkeiten, siRNAs herzustellen. Zum einen kann man sie durch verschiedene Methoden in vitro synthetisieren/transkribieren und präparieren und die synthetischen siRNAs in die Zellen einschleusen (z.B. durch Transfektion). Andererseits können sie auch in vivo von Expressionskassetten oder Expressionsplasmiden transkribiert werden. Dazu werden die Expressionskassetten oder die Plasmide in die Zellen transfiziert oder z.B. über virale Vektoren eingebracht (Brummelkamp et al., Science, 2002). Die meisten der im Folgenden vorgestellten Methoden erfordern das Design einer individuellen siRNA-Sequenz bevor mit der Präparation begonnen werden kann.
In vitro Synthese: Das einfachste Verfahren zur Herstellung von siRNAs ist die chemische Synthese des Sense- und Antisense-Stranges der designten siRNA-Sequenzen. In einem weiteren Schritt werden die beide Stränge zu doppelsträngiger siRNA annealt. Da alle auf diese Weise entstandenen siRNA-Moleküle die identische Sequenz haben, interagieren alle mit der gleichen Tagetsequenz, wodurch unspezifische Off-Target-Effekte auf ein Minimum reduziert werden. Mit dieser Methode kann eine relativ große Menge sehr reiner siRNA hergestellt werden. Nachteilig ist jedoch, daß dieses Verfahren verhältnismäßig teuer ist, was es für das Screening von siRNAs ungeeignet macht.
Ein sehr einfaches und preiswertes Verfahren ist die RNase III vermittelte Spaltung von langen dsRNA-Molekülen in siRNAs (Yang et al., Proc Natl Acad Sci, 2002). Die langen dsRNA-Moleküle werden durch in vitro Transkription von einem DNA-Template hergestellt. Typischer Weise kodiert dieses Template eine 200-1000 Nukleotid lange Region der Ziel-mRNA, welches zwischen zwei T7-Promotoren kloniert wird, siehe Abbildung. Mit Hilfe der T7-RNA-Polymerase wird davon die dsRNA transkribiert. Durch den Verdau der dsRNA mit der RNase III entsteht ein siRNA-Cocktail, der den gesamten Sequenzbereich des DNA-Templates repräsentiert.
Dieses Verfahren ist zur Herstellung von siRNAs, mit denen loss of function Phänotypen untersucht werden sollen, sehr gut geeignet. Allerdings ist es für sämtliche Analysen, die siRNA mit einer identischen Sequenz erfordern, ungeeignet. Ein weiterer Nachteil ist, daß sich innerhalb des siRNA-Pools mit erhöhter Wahrscheinlichkeit auch solche Moleküle befinden, die die mRNA unbeteiligter Gene erkennen und dadurch zu unspezifischen Off-Target-Effekten führen.
Eine weitere Möglichkeit in vitro siRNAs mit identischen Sequenzen herzustellen, ist die in vitro Transkription von Oligonukleotiden. Hierfür werden kurze DNA-Oligonukleotide, die den Sense- und Antisense-Sequenzbereich für die siRNA kodieren und an ihrem 5'-Ende zu der T7-Promotor-Primer-Sequenz homolog sind, hergestellt, siehe Abbildung. Nach der Hybridisierung mit dem T7-Promotor-Primer wird durch die DNA-Polymerase aus den Hybridisierungsprodukten doppelsträngige DNA synthetisiert. Mit der T7-Polymerase kann davon jeweils einzelsträngige siRNA transkribiert werden, die nach einem Annealing-Schritt in doppelsträngige siRNA überführt wird. Da es sich um ein preiswertes Verfahren handelt, mit dem siRNAs mit identischen Sequenzen hergestellt werden können, ist es für ein Screening von siRNA-Sequenzen geeignet. Ungeeignet ist es für Untersuchungen, die große Mengen an siRNA erfordern.
Der Nachteil von in vitro synthetisierter siRNA besteht darin, daß sie in die Zelle eingeschleust werden muß und dort auf Grund von degradativen Prozessen nur transient zum Silencing des Zielgens führt. Damit sind in vitro hergestellte siRNAs für Langzeitstudien ungeeignet.
Um Plasmide oder Vektoren zur Expression von siRNA zu nutzen, wird ein DNA-Oligonukleotid, welches die designte Sequenz für die siRNA kodiert, hinter einen Promotor kloniert (Sui et al., Proc Natl Acad Sci, 2002). Dafür wird häufig einer der drei verschiedenen RNA-Polymerase III-Promotoren eingesetzt, z.B. der in humanen und murinen Zellen gut untersuchte U6-Promotor oder der humane H1-Promotor. Diese Promotoren haben den Vorteil, daß sie relativ häufig abgelesen werden und dadurch relativ große Mengen RNA entstehen (Miyagishi and Taira, Nat Biotechnol, 2002). Im Oligonukleotid wird die siRNA-Sequenz durch zwei aufeinanderfolgende inverted repeats kodiert, die ihrerseits durch eine kurze Spacer-Region getrennt sind, siehe Abbildung. Für die eigentlichen Klonierungsschritte sind wiederum zwei zueinander komplementäre Oligonukleotide (Sense und Antisense) erforderlich. Am 5'- und am 3'-Ende beider Oligonukleotide befinden sich die Sequenzen für die Restriktionsschnittstellen, die sich nach dem Annealing ausbilden und für die gerichtete Klonierung in das Plasmid oder den Vektor erforderlich sind. Durch die Anordnung der siRNA-Sequenz in inverted repeats wird nach dem Einbringen des Vehikels in die Zelle ein RNA-Transkript synthetisiert, welches eine Haarnadelstruktur ausbildet (Paddison et al., Genes Devel, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci, 2002). Dieses siRNA-Vorläufermolekül wird durch Dicer erkannt und in die aktive siRNA prozessiert.
Obwohl die Herstellung von siRNA-exprimierenden Vektoren mit einem hohen zeitlichen Aufwand verbunden ist, der sie für das Screening von siRNA-Sequenzen untauglich macht, sind sie für Langzeitstudien hervorragend geeignet. Außerdem können Vektoren mit Antibiotikaresistenzmarkern benutzt werden, um Zellen anzureichern, die das Plasmid aufgenommen haben. Damit kann eine niedrige Transfektionsrate kompensiert werden.
Auf Grund ihrer hohen Effizienz und der beeindruckenden Liste der bisher durch RNAi stillgelegten Zielgene - von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen bis hin zu viralen Genen und Zelloberflächenrezeptoren - wird gegenwärtig ihr Einsatz als Therapeutikum untersucht (Wall and Shi, Lancet, 2003). Von besonderem Interesse ist dabei die Behandlung von Erkrankungen, gegen die bisher keine oder nur begrenzt wirkende Medikamente verfügbar sind. Die Zugänglichkeit der Zielorgane für die applizierten siRNA-Moleküle spielt dabei allerdings eine entscheidende Rolle.
Die altersabhängige Makula Degneration (AMD) ist der Hauptgrund für Erblindungen in der Welt. Mit fortgeschrittenem Alter degenerieren die retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen in der Makula, dem Bereich der Netzhaut, der für das scharfe Sehen verantwortlich ist und der damit alltägliche Tätigkeiten, wie Schreiben, Lesen, Autofahren etc., ermöglicht. Der AMD liegen genetische Defekte zu Grunde, die durch bestimmte Umweltfaktoren und Verhaltensgewohnheiten zur Ausprägung kommen. Wesentlich am Fortschreiten der Krankheit beteiligt ist die Überexpression des vaskular endothelial growth factor (VEGF) durch RPE-Zellen, die zum Einwachsen von Blutgefäßen in die Netzhaut führt, wodurch die RPE-Zellen zerstört werden. Obwohl für bestimmte Formen der AMD Behandlungsmethoden verfügbar sind, können durch sie bestenfalls kurzzeitige Besserungen erreicht werden, eine ursächliche Therapie steht für die AMD jedoch nicht zur Verfügung.
Eine der natürlichen Funktionen von RPE-Zellen ist die Phagozytose von zellulärem Material, um die Funktionalität der Netzhaut zu gewährleisten. Wahrscheinlich ist es dieser Mechanismus, der auch zu einer schnellen Aufnahme von siRNA durch die RPE-Zellen führt und sie damit für einen siRNA-basierten Therapiensatz geeignet macht. Erste klinische Studien für einen anti-VEGF siRNA-Ansatz sind bereits geplant (Acuity, SIRNA).
Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist mit 4% aller Krebserkrankungen eine der häufigsten Krebserkrankung weltweit mit einer extrem schlechten Prognose. HCC-Patienten sterben innerhalb von 5 Jahren nach Diagnose. Neben verschiedenen Umweltfaktoren spielen Infektionen mit Hepatitis Viren, wie z.B. dem Hepatitis B Virus (HBV) und dem Hepatitis C Virus (HCV) eine große Rolle. 70-85% der HCC-Erkrankungen sind auf Infektionen mit diesen Viren zurückzuführen.
Trotzdem eine wirksame Impfung gegen HBV verfügbar ist, sind weltweit etwa 450 Million Menschen mit dem Virus infiziert. In etwa 10% der Infektionen bei Erwachsenen und in etwa 90% der Infektionen bei Kindern kommt es zu chronischen Leberentzündungen, die mit einem stark erhöhten Risiko (300fach) an HCC zu erkranken verbunden sind.
Gegen HCV ist keine Impfung verfügbar. Weltweit tragen 200 Million Menschen dieses Virus, welches in nahezu 100% der Fälle zu chonischen Leberentzündungen führt.
Für beide virale Infektionen erscheint ein siRNA-Ansatz erfolgversprechend, da die Leber, das Zielorgan beider Viren, siRNAs sehr gut aufnimmt und sogar für einige Tage speichert.
Zum Schutz vor Infektionen mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) ist immer noch keine Impfung vorhanden. Gegenwärtig sind etwa 70 Million Menschen mit HIV infiziert und 42 Million Menschen an AIDS erkrankt. Es wird geschätzt, dass 2002 5 Million Menschen neu mit dem HIVirus infiziert wurden und 3 Million an den Folgen der HIV-Infektion gestorben sind. Die momentan verwendeten Behandlungstrategien beruhen auf Kombinationstherapien, die die virale reverse Transkriptase, die virale Protease und den Eintritt des Virus in die Zelle hemmen, sie sind jedoch von starken Nebenwirkungen begleitet und die hohe Mutationsrate des Virus ermöglicht nur eine Behandlung über kurze Zeit.
Der siRNA-Ansatz erscheint aus verschiedenen Gründen für die Behandlung von HIV-Infektionen als geeignet. Lymphozyte, das Haupttarget von HIV, sind mit dsRNA addressierbar. Die Replikation des HIVirus konnte erfolgreich in Lymphozyten in vitro durch die Transfektion von dsRNA inhibiert werden (Jacque et al., Nature, 2002). Lee et al. konnten eine 1000fache Inhibition der HIV-Expression durch Vektor-exprimierte siRNAs messen (Nat Biotechnology, 2002). Die schnelle Mutationsrate von HIV stellt allerdings auch für einen siRNA basierten Ansatz ein großes Problem dar.
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